Guillaume Gallienne sort du Conservatoire national supérieur d’art dramatique en 1998 (classes de Dominique Valadié, Stéphane Braunschweig, Daniel Mesguich) pour intégrer la Comédie-Française dont il devient sociétaire en 2005 et où il interprète les grands textes du répertoire. On a pu le voir dans Un fil à la patte de Feydeau, Lucrèce Borgia de Hugo, Les Damnés de Visconti et, récemment, dans Le Malade imaginaire et Le Bourgeois Gentilhomme de Molière. En dehors de la Troupe, il collabore en 2005 à l’écriture de l’argument du ballet Caligula chorégraphié par Nicolas Le Riche à l’Opéra national de Paris, et en signe la dramaturgie. Il met en scène en 2006 Huis clos de Jean‑Paul Sartre au Théâtre Nô Tessenkai à Tokyo et crée en 2008 Les Garçons et Guillaume, à table ! au Théâtre de l’Ouest Parisien. Il conçoit la dramaturgie des Illusions perdues, ballet d’Alexeï Ratmansky, au Théâtre Bolchoï à Moscou en 2011, et celle de Of Love and Rage, toujours d’Alexeï Ratmansky, avec l’American Ballet Theater en 2020. En 2017, La Cenerentola à l’Opéra national de Paris est sa première mise en scène lyrique. Au cinéma, il joue dans des films comme Jet Set de Fabien Oteniente, Marie-Antoinette de Sofia Coppola, Fauteuils d’orchestre et Cézanne et moi de Danièle Thompson, Le Candidat de Niels Arestrup, Sagan de Diane Kurys, Yves Saint-Laurent et Le Dindon de Jalil Lespert, Éperdument de Pierre Godeau, Kaamelott d’Alexandre Astier et The French Dispatch de Wes Anderson… En 2013, il adapte au cinéma Les Garçons et Guillaume, à table !, pour lequel il obtient quatre Césars dont celui de meilleur acteur et meilleur film. Son second long-métrage, Maryline, est sorti sur les écrans en 2017. De 2008 à 2010, il écrit et interprète Les Bonus de Guillaume pour Le Grand Journal de Canal + et, de 2009 à 2020, il présente sur France Inter Ça peut pas faire de mal, une émission consacrée à la lecture. Il est chevalier dans l’ordre national du Mérite et officier de l’ordre des Arts et des Lettres.